KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

1.      PRINSIP

Pemisahan senyawa bedasarkan kepolaran, ukuran partikel, ionik atau khiral tergantung dari jenis kolom

2.      KEGUNAAN

Pemisahan untuk senyawa yang lebih dari tiga sampel tanpa pemisahan terlebih dahulu

3.      KEUNTUNGAN

a.       Waktu analisis cepat

b.      Daya pisah baik

c.       Peka

d.      Pemilihan kolom dan eluen sangat bervariasi

e.       Kolom bisa dipakai kembali

f.        Bisa dipakai untuk analisis molekul besar dan kecil

g.      Cuplikan mudah diperoleh kembali

h.      Detektor tidak merusak komponen zat yang akan dianalisis

i.        Dapat menghitung zat dengan kadar yang sangat rendah

4.      FASE YANG DIGUNAKAN

a.       Fase diam (kolom) : padatan, fel, kombinasi padatan-cairan

b.      Fase gerak (eluen/pelarut) : cairan , gas

5.      INSTRUMEN KCKT

a.       Pompa : untuk mengalirkan eluen kedalam kolom

Kolom terbagi atas 2:

-          Kolom penghantar tekanan konstan  : pompa pneumatik, pompa ampifier

-          Kolom sistem pemindahan konstan : pompa semprot, pompa bolak balik

b.      Injektor : untuk memasukkan cuplikan kedalam kolom

c.       Kolom : untuk pemisahan sampel

d.      Detektor : mendetekdi komponen yang ada dan mengukur jumlahnya

e.       Integrator : menghitung luas puncak

6.      SYARAT DETEKTOR

a.       Respon universal

b.      Sensitivitas tinggi

c.       Noisy rendah

d.      Kisaran linear dinamis

e.       Respon tidak dipengaruhi variasi parameter

f.        Respon tidak dipengaruhi komposisi fase gerak

g.      Mudah digunakan dan dipercaya

h.      Tidak merusak analit

i.        Tidak mahal

j.        Respon stabil

k.      Mampu memberi informasi kwalitatif mengenai analit

7.      JENIS-JENIS DETEKTOR

a.       Detektor serapan optik : mendeteksi komponen yang menyerap cahaya

o   Didaerah UV : 200-400 nm

Untuk senyawa yang punya gugus kromofor, punya ikatan rangkap terkongjugasi

o   Sinat tampak : 400-800 nm

o   IR: 2-25 nanometer

b.      Detektor indeks bias : mendeteksi perubahan indeks bias yang disebabkan perubahan cuplikan

c.       Detektor flouresensi : mendeteksi komponen-komponen yang berflouresensi

d.      Detektor  elektrokimia : hanya mendeteksi komponen polar

e.       Detektor ionisasi nyala : mendeteksi nyala

f.        Detektor hamburan cahaya evaporasi

g.      Detektor radioaktif : mendeteksi zat yang memancarkan radiasi

8.      PEMILIHAN FASE DIDASARKAN PADA:

a.       Kesesuaian dengan mekanisme pemisahan

b.      Kemampuan melarutkan cuplikan

c.       Kepolaran yang bisa diubah dengan mengubah komposisi

9.      SYARAT ELUEN YANG BAIK

a.       Murni

b.      Tidak bereaksi dengan kolom

c.       Sesuai detektor

d.      Dapat melarutkan cuplikan

e.       Selektivitas terhadap komponen

f.        Viskositas rendah

g.      Cuplikan bisa diperoleh kembali

h.      Harga wajar

i.        Dapat memisah dengan baik

10.  JENIS KCKT BERDASARKAN FASE

a.       KCKT absorbsi

b.      KCKT ion

c.       KCKT partisi

d.      KCKT eklusi

11.  UJI KESESUAIN SISTEM

a.       α ( faktor selektivitas)

menunjukkan seberapa baik kromatografi dapat memisahkan komponen

α = (tr₂-tr₁) / (tr₁-tm)

      = k`2 / k`1

 Jika α = 1 à tidak terjadi pemisahan,  jika α = 2 àpemisahan baik

b.      K` (faktor kapasitas)

Menunjukkan seberapa kuat komponen-komponen dalam sampel yang dibawa oleh fase gerak berinteraksi dengan kolom (fase diam)

K`1            =  (tr₁-tm) / tm

Jika K` = 0 à tidak terjadi pemisahan, jika K` = 2-8 à pemisahan baik

c.        Rs (resolusi)

Menunjukkan ukuran apakah senyawa terpisah secara baik dengan senyawa lain atau tidak

R =            ( 2  (tr₂-tr₁) ) / (wa + wb )

R ≥ 1,5 àpemisahan baik

d.      N (efisiensi kolom)

N = 16 (tr / w)²

N baik jika > 2500

Harga N dipengaruhi oleh konstruksi kolom, sifat sampel, laju alir, suhu, cara pemisahan sampel.

Semakin besar nilai N, maka semakin sempit harga peak, maka makin baik resolusi.

HETP = L/N

                        =L/16 X (w / tr)²

                                Kolom efisen apabila harga HETP lebih kecil          

e.       Tf (faktor simetri)

Untuk melihat apakah puncak simetris atau tidak

b/a = 1

keterangan rumus :

tr = waktu retensi (menit) à waktu lamanya suatu senyawa ditahan dalam kolom sampai muncul puncak pertama

tm = waktu fase gerak

w = luas alas

Sumber:

“Analisis Fisikokimia : Kromatografi Volume 2”

Oleh : Prof. Dr. Harmita, Apt.

Penerbit: buku kedokteran EGC